精准检测,助力更好的CAR-T治疗

什么是CAR-T细胞药物?

随着肿瘤免疫治疗的发展,结合了抗体和免疫细胞优势的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞免疫治疗受到极大关注。CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。膜外抗原结合区具有特异性识别并结合靶细胞表面抗原的功能,其构成源于单克隆抗体的单链可变区结构域(Single Chain Variable Fragment,scFv),由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。细胞内信号转导区主要由共刺激信号和T细胞受体(TCR)的CD3zeta链组成。表达CAR的T(CAR-T)细胞通过scFv与靶细胞抗原结合后,胞内信号转导区将信号传入T细胞,从而激活T细胞,分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等,发挥杀伤作用。目前FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物,分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah,和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞肿瘤,采用了相同的抗原结合区,即来源于鼠单克隆抗体FMC63的scFv。

CAR-T细胞检测有哪些应用?

构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达,在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时,CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此,准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T细胞药物质量控制的关键步骤,也是临床病人治疗剂量控制、过程监测及辅助诊断的重要环节。

常见的CAR-T细胞检测方法有哪些?

常见的检测方法有两种:检测CAR基因阳性T细胞(定量PCR/qPCR)和检测CAR蛋白阳性T细胞(流式细胞法/FACS)。

  1. qPCR是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可以检测细胞基因组上整合的CAR基因,以及CAR基因的拷贝数。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞,因为有一部分整合了CAR基因的T细胞可能没有正常表达CAR1,这些T细胞带来的假阳性降低了qPCR方法应用的准确性。更为严重的是,qPCR方法无法分辨CAR阳性T细胞和CAR阳性B细胞,从而难以发现CAR阳性B细胞引发的治疗和复发风险2。此外,qPCR无法满足对细胞表面多种标志物同时检测的需求,这进一步限制了qPCR的应用。
  2. FACS是检测CAR蛋白阳性T细胞的主要方法。中国食品药品检定研究院在《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》中明确提出:应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率,目前有针对CAR不同结构区域的检测方法,包括针对CAR抗原结合位点的,如CD19抗原或抗scFv抗体,或针对轻链或铰链区的抗Fab或Protein L,与其它两种方法相比,针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方法具有更好的专属性。

CAR-T细胞FACS检测试剂有哪些?

  1. 以Anti-CD19 CAR-T为例,常见的FACS检测试剂包括:抗鼠IgG (Fab’)2、Protein L、CD19抗原、鼠单抗20.11、兔单抗R19M。
  2. 其中,抗鼠IgG (Fab’)2和Protein L无法区分鼠源不同scFv构建的不同CAR(例如CD22 CAR、BCMA CAR等),检测专属性差;CD19抗原与Anti-CD19 CAR上的抗CD19 scFv结合的亲和力不高2,导致检测的灵敏度较低,仅达到5/10003,即1000个细胞中有5个以上的阳性细胞才能检测到;诺华公司用于临床检测的鼠单克隆抗体20.1是针对Anti-CD19 CAR上FMC63 scFv的抗体,检测灵敏度接近1/1000,应用于体内Anti-CD19 CAR阳性细胞检测仍存在灵敏度不高的缺陷。
  3. 兔单抗R19M是星湾公司自主开发的Anti-CD19 CAR-T检测抗体,灵敏度达到1/100000,不仅适用于CAR-T细胞研发、生产质控,更满足CAR-T药代研究、体内CAR-T长期监测等需求。

CAR-T检测方法

构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或⾮非病毒系统转染 并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达,在细胞膜上形成跨 膜的CAR结构时,CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。 因此,准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量量控制的 关键步骤,也是临床病人治疗剂量量控制、过程监控及辅助诊断的 重要环节。常见的检测方法有两种类型:检测CAR基因阳性T细胞 和检测CAR蛋白阳性T细胞。

灵敏但不准确的qPCR

qPCR是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可 以检测细胞基因组上整合的CAR基因,以及CAR基因的拷贝数。 但该方法难以准确反映表达CAR的阳性T细胞,因为有一部分整合 了了CAR基因的T细胞没有正常表达CAR(Jennifer N. Brudno, et al., Journal of Clinical Oncology, 2016),这些T细胞带来的假 阳性降低了了qPCR方法应用的准确性。更更为严重的是,qPCR方法 无法分辨CAR阳性T细胞和CAR阳性B细胞,从而难以发现CARB 细胞引发的治疗和复发风险(Marco Ruella, et al., Nature Medicine, 2018)。此外,qPCR方法无法满足对T细胞多种表面 标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测的需求,这进一步限 制了了qPCR方法的应。

为精准的流式细胞法检测

“……应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率,目前有针对 CAR不不同结构区域的检测方法,包括针对CAR抗原结合位点的,如 CD19抗原或抗ScFv抗体,或针对轻链或铰链区的抗Fab或Protein L,与其它两种方法相比,针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方 法具有更更好的专属性。”
——中国食品药品检定研究院《CAR-T细胞治疗产品质量量控制 检测研究及非临床研究考虑要点》,2018。

常用试剂比较

现有检测试剂包括抗鼠IgG (Fab’)2、Protein L、CD19/Fc、鼠 单抗136.20.1(Bipulendu Jena, et al., PLoS One, 2013)。其中, 抗鼠IgG (Fab’)2和Protein L检测anti-CD19 CAR的专属性差,无法 区分鼠源不同scFv构建的不同CAR(如CD22 CAR、BCMA CAR 等);CD19/Fc依赖于CD19蛋白与CAR上的FMC63 scFv的结合, 由于该scFv与CD19的亲和力低于完整抗体FMC63与CD19的亲和力 (IAN C. Nicholson, et al., Molecular Immunology, 1997),因此 CD19/Fc检测anti-CD19 CAR的灵敏敏度较低;鼠单抗136.20.1特异性针对anti-CD19 CAR上的FMC63 scFv,检测专属性好,其灵敏度接近1:1000,即1000个细胞中检测出1个anti-CD19 CAR阳性细胞,应用于体内CAR阳性细胞检测仍存在灵敏度不高的缺陷。以上所有试剂因为各自难以克服的原因,导致其应用范围较。

参考文献

CD4/CD8 T-Cell Selection Affects Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Potency and Toxicity: Updated Results From a Phase I Anti-CD22 CAR T-Cell Trial.

KTE-X19 CAR T-Cell Therapy in Relapsed or Refractory Mantle-Cell Lymphoma.

Not So FASt: Tumor Cells Resisting Death Drive CAR T-cell Dysfunction.

Tuning the Antigen Density Requirement for CAR T Cell Activity.

Persistent Polyfunctional Chimeric Antigen Receptor T Cells That Target Glypican 3 Eliminate Orthotopic Hepatocellular Carcinomas in Mice.

Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors.

Human Binding Domains Reduce Neurotoxicity of Anti-CD19 CAR-T Cells.

Impaired death receptor signaling in leukemia causes antigen-independent resistance by inducing CAR T cell dysfunction.

Safety and feasibility of anti-CD19 CAR T cells with fully human binding domains in patients with B-cell lymphoma.

Integrated drug profiling and CRISPR screening identify essential pathways for CAR T cell cytotoxicity.

Myeloid Cell-Targeted miR-146a Mimic Inhibits NF-kB-Driven Inflammation and Leukemia Progression in Vivo.

Preemptive Mitigation of CD19 CAR T Cell Cytokine Release Syndrome Without Attenuation of Anti-Leukemic Efficacy.

Specific stimulation of T lymphocytes with erythropoietin for adoptive immunotherapy.

CAR T cells targeting BAFF-R can overcome CD19 antigen loss in B cell malignancies.

Enhanced CAR T cell expansion and prolonged persistence in pediatric patients with ALL treated with a low-affinity CD19 CAR.

Tisagenlecleucel CAR-T Cell Therapy in Secondary CNS Lymphoma.

CD19 CAR T Cells Following Autologous Transplantation in Poor Risk Relapsed and Refractory B cell non-Hodgkin Lymphoma.

Cost Effectiveness of Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy in Multiply Relapsed or Refractory Adult Large B-Cell Lymphoma.

Sustained B cell depletion by CD19-targeted CAR T cells is a highly effective treatment for murine lupus.

Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy.

产品信息